商業(yè)模式的保護(hù)精選(五篇)
發(fā)布時(shí)間：2024-03-21 16:49:54
序言：作為思想的載體和知識(shí)的探索者，寫作是一種獨(dú)特的藝術(shù)，我們?yōu)槟鷾?zhǔn)備了不同風(fēng)格的5篇商業(yè)模式的保護(hù)，期待它們能激發(fā)您的靈感。
篇1
[關(guān)鍵詞] 會(huì)展 知識(shí)產(chǎn)權(quán) 商業(yè)模式
知識(shí)經(jīng)濟(jì)與互聯(lián)網(wǎng)時(shí)代到來至今，形成了多種嶄新的業(yè)態(tài)，會(huì)展商業(yè)模式創(chuàng)新也成為會(huì)展業(yè)不斷發(fā)展必不可少的原發(fā)動(dòng)力。要使這種創(chuàng)新源源流長(zhǎng)、要讓創(chuàng)造者積極所為，必須對(duì)該類創(chuàng)新實(shí)行制度性保護(hù)，對(duì)侵權(quán)人形成威懾性約束，對(duì)侵占他人權(quán)利行為實(shí)施懲罰性制裁。但目前，我國(guó)對(duì)會(huì)展商業(yè)模式保護(hù)的關(guān)注和研究尚未有效展開。
一、會(huì)展業(yè)知識(shí)產(chǎn)權(quán)保護(hù)歷程
作為現(xiàn)代服務(wù)業(yè)范疇的會(huì)展行業(yè),其知識(shí)產(chǎn)權(quán)保護(hù)最早可以追溯到1873年的“維也納國(guó)際發(fā)明展”。當(dāng)時(shí),展會(huì)舉辦國(guó)奧地利制定了一項(xiàng)特殊法律,向展會(huì)展出的各國(guó)發(fā)明、商標(biāo)和外觀設(shè)計(jì)提供特殊的臨時(shí)保護(hù)。會(huì)展行業(yè)知識(shí)產(chǎn)權(quán)保護(hù)由此起步。
歷史的腳步走到了21世紀(jì)門檻邊,全球會(huì)展行業(yè)早已織就了較為完整的知識(shí)產(chǎn)權(quán)保護(hù)網(wǎng),商標(biāo)、技術(shù)發(fā)明、外觀設(shè)計(jì)、新型應(yīng)用等一應(yīng)俱全。但也就在此時(shí),隨著計(jì)算機(jī)和網(wǎng)絡(luò)技術(shù)的廣泛應(yīng)用,實(shí)踐中出現(xiàn)了除已經(jīng)被完善保護(hù)的傳統(tǒng)知識(shí)產(chǎn)權(quán)形態(tài)外的樣式繁多的會(huì)展商業(yè)模式。就是這類集人類智慧、借助現(xiàn)代技術(shù)手段實(shí)現(xiàn)的創(chuàng)新活動(dòng),卻因其遲到,被拒在了已有的知識(shí)產(chǎn)權(quán)保護(hù)網(wǎng)之外。
為了保證并促進(jìn)對(duì)各國(guó)經(jīng)濟(jì)繁榮起到積極推動(dòng)作用的會(huì)展業(yè)的發(fā)展,面對(duì)出現(xiàn)的問題,各國(guó)相關(guān)學(xué)界、政府部門和企業(yè),逐步投入到了會(huì)展行業(yè)商業(yè)模式保護(hù)的研究和實(shí)踐之中,領(lǐng)頭的自然還是發(fā)達(dá)工業(yè)國(guó)。
二、商業(yè)模式及會(huì)展商業(yè)模式保護(hù)現(xiàn)狀
1.發(fā)達(dá)國(guó)家的研究與實(shí)踐
(1)美國(guó)專利商標(biāo)局(USPTO)于2000年3月公布了一項(xiàng)應(yīng)對(duì)商業(yè)模式專利的行動(dòng)計(jì)劃。該計(jì)劃的內(nèi)容主要包括:修訂商業(yè)模式發(fā)明專利的審查標(biāo)準(zhǔn)，擴(kuò)大對(duì)美國(guó)“專利分類705”申請(qǐng)案件的檢索范圍，加強(qiáng)專利審查員的培訓(xùn)，以及保證對(duì)商業(yè)模式專利申請(qǐng)進(jìn)行適格性、新穎性和非顯而易見性的實(shí)質(zhì)審查。USPTO還在2000年7月公布的商業(yè)模式專利白皮書中對(duì)商業(yè)模式專利的演變、“專利分類705”，以及專利審查員的培訓(xùn)方式做出了詳細(xì)的說明，旨在進(jìn)一步規(guī)范該類專利審查的標(biāo)準(zhǔn)。此外，USPTO還創(chuàng)建了“技術(shù)中心2100”，專門審理“專利分類705”類目中的申請(qǐng)。統(tǒng)計(jì)數(shù)字表明，第705類專利在1999年之后急劇上升，從1995年申請(qǐng)數(shù)的170件猛增到2000年的7800件，2001年達(dá)到1萬件。經(jīng)過幾年的實(shí)踐，在“陽光下一切人類的發(fā)明創(chuàng)造均可獲得專利”的呼聲中，商業(yè)模式在美國(guó)獲得專利保護(hù)已不是問題，美國(guó)專利商標(biāo)局和法學(xué)家們現(xiàn)在研究并更為關(guān)注的是，如何使該類專利審查制度穩(wěn)定并規(guī)范。
(2)歐盟專利局曾一度將商業(yè)模式排除在專利保護(hù)之外。根據(jù)《歐洲專利公約》第52條規(guī)定，科學(xué)原理、數(shù)學(xué)方法、實(shí)施心理活動(dòng)游戲或商業(yè)模式的技術(shù)、規(guī)則、方案,以及計(jì)算機(jī)程序、信息的表達(dá)是不可授予專利的。但隨著美國(guó)率先認(rèn)可了商業(yè)模式可以成為專利法保護(hù)的客體后，為了在國(guó)際知識(shí)產(chǎn)權(quán)的競(jìng)爭(zhēng)中取得優(yōu)勢(shì)地位，歐洲專利局的態(tài)度也開始傾向于承認(rèn)商業(yè)模式的可專利性。2001年11月歐洲專利局了新的專利審查指南，確認(rèn)了其在計(jì)算機(jī)軟件和商業(yè)模式上的擴(kuò)大保護(hù)政策。根據(jù)該審查指南，商業(yè)模式的可專利性已不容置疑。歐洲專利局在處理一項(xiàng)商業(yè)模式專利的申請(qǐng)中，更加注重對(duì)其創(chuàng)造性和技術(shù)特征的判斷，而非僅僅審查其是否屬于商業(yè)模式本身。在經(jīng)過了長(zhǎng)期的、多方的辯論之后，歐洲的態(tài)度已由對(duì)商業(yè)模式專利的強(qiáng)烈反對(duì)轉(zhuǎn)變?yōu)椴辉俚种?，即商業(yè)模式可以通過“技術(shù)包裝”而獲得專利法的保護(hù)。
(3)日本在對(duì)待商業(yè)模式專利的問題上采取了實(shí)用主義的策略和主張。2000年日本特許廳修訂了《專利審查指南》，增加了與商業(yè)模式有關(guān)的發(fā)明創(chuàng)造的實(shí)施例，對(duì)利用網(wǎng)絡(luò)或計(jì)算機(jī)的商業(yè)模式不再被視為抽象的概念，可以在日本獲得專利法的保護(hù)。此后，日本又于2002年修改了本國(guó)的《發(fā)明專利法》；2003年，日本知識(shí)產(chǎn)權(quán)戰(zhàn)略本部又公布了“知識(shí)產(chǎn)權(quán)戰(zhàn)略推進(jìn)計(jì)劃”，充分表明了其積極提升本國(guó)知識(shí)產(chǎn)權(quán)競(jìng)爭(zhēng)力的態(tài)度和決心。
2.國(guó)內(nèi)研究與實(shí)踐
(1)會(huì)展實(shí)踐方面。針對(duì)國(guó)內(nèi)會(huì)展商業(yè)模式的表現(xiàn)形式,已有不少公開報(bào)道。如上海世博會(huì)標(biāo)志特許經(jīng)營(yíng)的運(yùn)營(yíng)模式;第二屆中國(guó)(深圳)國(guó)際科學(xué)生活博覽會(huì)結(jié)合全國(guó)性的活動(dòng)和互聯(lián)網(wǎng)及媒體的資源，確立了三大平臺(tái)互動(dòng)的全新展會(huì)運(yùn)營(yíng)模式;慧聰網(wǎng)水工業(yè)產(chǎn)品采購(gòu)交易會(huì)和慧聰網(wǎng)泵閥產(chǎn)品采購(gòu)交易會(huì)將傳統(tǒng)貿(mào)易展覽會(huì)和電子商務(wù)有機(jī)結(jié)合,形成“采購(gòu)交易會(huì)＋電子商務(wù)平臺(tái)”――線上線下互動(dòng)模式等等。此外,國(guó)內(nèi)還有對(duì)諸如基于會(huì)展會(huì)后服務(wù)的商業(yè)模式、商業(yè)會(huì)展市場(chǎng)推廣的整合模式、市場(chǎng)化運(yùn)作展會(huì)模式等都進(jìn)行過報(bào)道。
(2)司法實(shí)踐方面。2000年3月，上海卓尚信息有限公司告e龍網(wǎng)信息技術(shù)北京有限公司“網(wǎng)上商業(yè)模式侵權(quán)案”，出現(xiàn)了號(hào)稱“中國(guó)網(wǎng)上商業(yè)模式保護(hù)第一案”；2007年5月，北京首都在線網(wǎng)絡(luò)技術(shù)有限公司提出“網(wǎng)絡(luò)桌面媒體”商業(yè)模式的專利申請(qǐng)，出現(xiàn)了我國(guó)“商業(yè)模式保護(hù)”專利申請(qǐng)第一案。
(3)法規(guī)方面。2004年10月1日國(guó)家知識(shí)產(chǎn)權(quán)局于新頒布了《商業(yè)模式相關(guān)發(fā)明專利申請(qǐng)的審查規(guī)則(試行)》;2006年5月30日,國(guó)家版權(quán)局、信產(chǎn)部頒發(fā)的《互聯(lián)網(wǎng)著作權(quán)行政保護(hù)辦法》開始實(shí)行等。
另據(jù)國(guó)家知識(shí)產(chǎn)權(quán)局新聞發(fā)言人2007年介紹：從2006年開始，中國(guó)《專利法》進(jìn)行第三次修改，送審稿當(dāng)年年底已正式提交國(guó)務(wù)院審議。又據(jù)國(guó)家保護(hù)知識(shí)產(chǎn)權(quán)工作組辦公室主任、商務(wù)部副部長(zhǎng)在2007年介紹：“2007年政府部門在加強(qiáng)對(duì)知識(shí)產(chǎn)權(quán)的司法保護(hù)方面一個(gè)顯著的特點(diǎn)就是，要進(jìn)一步根據(jù)《專利法》修改情況研究制定涉及侵犯專利權(quán)認(rèn)定標(biāo)準(zhǔn)的司法解釋；通過對(duì)知識(shí)產(chǎn)權(quán)行政案件司法審查的范圍、標(biāo)準(zhǔn)、程序、裁判方式等問題的調(diào)研，推動(dòng)出臺(tái)司法解釋。”
3.結(jié)論
(1)對(duì)“商業(yè)模式”作為知識(shí)產(chǎn)權(quán)的一種類型進(jìn)行保護(hù)已形成共識(shí)。從上述內(nèi)容可以看到,以美、歐、日為代表的發(fā)達(dá)工業(yè)國(guó)對(duì)商業(yè)模式保護(hù)在本世紀(jì)初就從研究、立法、實(shí)施等各層面全面展開,我國(guó)也已在2004年頒布了相應(yīng)的審查規(guī)則。
(2)保護(hù)方式多采用專利保護(hù)形式。知識(shí)產(chǎn)權(quán)保護(hù)方式通常為著作權(quán)保護(hù)、商標(biāo)保護(hù)、專利法保護(hù)和反不正當(dāng)競(jìng)爭(zhēng)等。歸納國(guó)內(nèi)外已有的實(shí)踐和研究,對(duì)商業(yè)模式的保護(hù)主要采用專利保護(hù)法。
(3)會(huì)展行業(yè)商業(yè)模式保護(hù)尚未涉及。一方面,會(huì)展行業(yè)知識(shí)產(chǎn)權(quán)保護(hù)目前仍局限于商標(biāo)、技術(shù)發(fā)明、外觀設(shè)計(jì)、新型應(yīng)用等傳統(tǒng)領(lǐng)域,而對(duì)其商業(yè)模式保護(hù)國(guó)外也剛剛起步,國(guó)內(nèi)未曾涉足。另一方面,現(xiàn)有商業(yè)模式保護(hù)的成功案例,無論國(guó)內(nèi)還是國(guó)外,都集中在電子商務(wù)、網(wǎng)絡(luò)游戲、金融和商業(yè)行業(yè),在會(huì)展行業(yè)基本沒有實(shí)踐和研究。
三、會(huì)展商業(yè)模式保護(hù)的重要性與緊迫性
1.會(huì)展業(yè)的健康發(fā)展對(duì)上海的經(jīng)濟(jì)發(fā)展具有重要意義
上海市委書記在近期的市委常委會(huì)上指出：“上海轉(zhuǎn)變經(jīng)濟(jì)發(fā)展方式迫在眉睫，現(xiàn)代服務(wù)業(yè)的發(fā)展決定上海未來。”上海近幾年致力于發(fā)展的和發(fā)展最快的是現(xiàn)代服務(wù)業(yè)，2006年GDP比重已經(jīng)超過全市的50%，而會(huì)展業(yè)則是其中重要的一塊，其增長(zhǎng)速度在最近的10年每年超過20%，而且還在緊鑼密鼓籌辦世博會(huì)。
2.會(huì)展業(yè)的健康發(fā)展需要更加完善的知識(shí)產(chǎn)權(quán)保護(hù)
上海把現(xiàn)代服務(wù)業(yè)中的會(huì)展業(yè)作為重點(diǎn)發(fā)展點(diǎn)，而且作為2010年世博會(huì)的舉辦地，上海自覺不自覺、愿意不愿意都已成為世界會(huì)展領(lǐng)域的矚目地，也必將成為會(huì)展行業(yè)知識(shí)產(chǎn)權(quán)保護(hù)的中心舞臺(tái)。面對(duì)行業(yè)內(nèi)出現(xiàn)的知識(shí)產(chǎn)權(quán)保護(hù)的新內(nèi)容、新問題，如何提升國(guó)內(nèi)會(huì)展行業(yè)知識(shí)產(chǎn)權(quán)保護(hù)水平？是否需要對(duì)會(huì)展商業(yè)模式實(shí)行保護(hù)？怎樣有效實(shí)現(xiàn)對(duì)會(huì)展商業(yè)模式的保護(hù)？如何與國(guó)際接軌、是模仿還是創(chuàng)新？世博會(huì)期間站在世界會(huì)展舞臺(tái)中心的上海，在知識(shí)產(chǎn)權(quán)保護(hù)方面應(yīng)該以什么樣的形象出現(xiàn)？怎樣體現(xiàn)希望的形象？……這些都是值得研究，而且是即待研究。
3.會(huì)展商業(yè)模式保護(hù)的完善，有利于整體創(chuàng)新環(huán)境優(yōu)化
總書記2008年6月23日在“兩院院士大會(huì)”上指出：“轉(zhuǎn)變發(fā)展方式、實(shí)現(xiàn)經(jīng)濟(jì)社會(huì)又好又快發(fā)展，迫切需要我們加緊建設(shè)創(chuàng)新型國(guó)家”；“建設(shè)創(chuàng)新型國(guó)家，這是國(guó)家發(fā)展戰(zhàn)略的核心”；“自主創(chuàng)新能力是國(guó)家競(jìng)爭(zhēng)力的核心”。
會(huì)展商業(yè)模式創(chuàng)新和保護(hù)是知識(shí)產(chǎn)權(quán)保護(hù)的新領(lǐng)域，會(huì)展業(yè)又是現(xiàn)代服務(wù)業(yè)的重要組成部分，是上海經(jīng)濟(jì)轉(zhuǎn)型發(fā)展的方向之一。開展會(huì)展商業(yè)模式保護(hù)研究，不但有利于知識(shí)產(chǎn)權(quán)保護(hù)水平的提高，也有利于創(chuàng)新城市乃至創(chuàng)新型國(guó)家的建設(shè)。
參考文獻(xiàn)：
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關(guān)鍵詞：互聯(lián)網(wǎng)保險(xiǎn) 商業(yè)模式 發(fā)展策略
課題：
1、高職保險(xiǎn)專業(yè)群人才培養(yǎng)模式研究 湖南省十二五教育規(guī)劃課題，編號(hào)：XJK012CZJ104。
2、湖南經(jīng)濟(jì)發(fā)展中的保險(xiǎn)支撐機(jī)制與實(shí)證研究――以服務(wù)“四化兩型”建設(shè)為視角 編號(hào)：14C0004。
互聯(lián)網(wǎng)保險(xiǎn)是普惠保險(xiǎn)（Inclusive insurance）中的一種新興業(yè)態(tài)，在2013年，眾安在線宣布網(wǎng)絡(luò)險(xiǎn)企，互聯(lián)網(wǎng)保險(xiǎn)成為名極一時(shí)的財(cái)經(jīng)新聞。根據(jù)相關(guān)研究資料顯示，在2012～2013年，經(jīng)營(yíng)互聯(lián)網(wǎng)保險(xiǎn)業(yè)務(wù)的主體從32家上升到63家；互聯(lián)網(wǎng)保險(xiǎn)保費(fèi)收入從35.12億元上升到301.02億元；投?？蛻魯?shù)從823.51萬人增長(zhǎng)到5632.54萬人。從上述數(shù)據(jù)不難看出，互聯(lián)網(wǎng)保險(xiǎn)在我國(guó)的增長(zhǎng)態(tài)勢(shì)可喜?；ヂ?lián)網(wǎng)對(duì)我國(guó)保險(xiǎn)業(yè)帶來深遠(yuǎn)而又持久的影響，發(fā)展互聯(lián)網(wǎng)保險(xiǎn)成為我國(guó)保險(xiǎn)行業(yè)發(fā)展的必然選擇。為了能夠規(guī)范互聯(lián)網(wǎng)保險(xiǎn)市場(chǎng)和保護(hù)消費(fèi)者的合法權(quán)益，互聯(lián)網(wǎng)保險(xiǎn)應(yīng)該注重以下幾個(gè)方面：注重產(chǎn)品創(chuàng)新；注重線上和線下的結(jié)合；開展大數(shù)據(jù)分析；注重創(chuàng)新商業(yè)模式。
一、互聯(lián)網(wǎng)保險(xiǎn)
目前來看，對(duì)互聯(lián)網(wǎng)保險(xiǎn)沒有形成一個(gè)統(tǒng)一的定義。根據(jù)保險(xiǎn)協(xié)會(huì)對(duì)互聯(lián)網(wǎng)保險(xiǎn)的定義不發(fā)現(xiàn)，互聯(lián)網(wǎng)保險(xiǎn)主要指的是保險(xiǎn)中介機(jī)構(gòu)通過互聯(lián)網(wǎng)為客戶提供相關(guān)服務(wù)信息，實(shí)現(xiàn)以下幾種業(yè)務(wù)：投保；承保；核保；保全；理賠等。互聯(lián)網(wǎng)保險(xiǎn)完成的在線服務(wù)和在線銷售等功能，通過第三方機(jī)構(gòu)實(shí)現(xiàn)電子支付等經(jīng)營(yíng)管理活動(dòng)?；ヂ?lián)網(wǎng)保險(xiǎn)不僅僅是對(duì)傳統(tǒng)保險(xiǎn)商業(yè)模式的改革，而且還 是一種新的銷售渠道。不管如何定義互聯(lián)網(wǎng)，均需要從以下幾個(gè)角度出發(fā)：
一是互聯(lián)網(wǎng)保險(xiǎn)產(chǎn)品。首先，以互聯(lián)網(wǎng)作為保險(xiǎn)業(yè)的銷售渠道之后，保險(xiǎn)企業(yè)應(yīng)該要以客戶為中心，開發(fā)適合互聯(lián)網(wǎng)的保險(xiǎn)產(chǎn)品；其次，隨著互聯(lián)網(wǎng)行業(yè)的不斷發(fā)展，保險(xiǎn)作為管理的有效手段，保險(xiǎn)企業(yè)應(yīng)該充分觀察到潛在風(fēng)險(xiǎn)，開發(fā)互聯(lián)網(wǎng)經(jīng)濟(jì)風(fēng)險(xiǎn)的保險(xiǎn)產(chǎn)品，發(fā)揮出保險(xiǎn)為社會(huì)經(jīng)濟(jì)發(fā)展的保護(hù)功能；
二是使用互聯(lián)網(wǎng)技術(shù)和互聯(lián)網(wǎng)思維經(jīng)營(yíng)管理保險(xiǎn)企業(yè)。保險(xiǎn)企業(yè)需要在互聯(lián)網(wǎng)思維背景下制定相關(guān)經(jīng)營(yíng)戰(zhàn)略，建立全新的經(jīng)營(yíng)體系，將開放和協(xié)作等互聯(lián)網(wǎng)精神貫穿于保險(xiǎn)經(jīng)營(yíng)管理的全過程中，為客戶提供更為滿意的服務(wù)；
三是在線經(jīng)營(yíng)保險(xiǎn)業(yè)務(wù)。在線經(jīng)營(yíng)保險(xiǎn)業(yè)務(wù)將保險(xiǎn)產(chǎn)品信息展示和理賠等業(yè)務(wù)工作在網(wǎng)上去完成，代替?zhèn)鹘y(tǒng)電話服務(wù)和紙質(zhì)服務(wù)；
四是在線銷售保險(xiǎn)產(chǎn)品。要想促進(jìn)保險(xiǎn)銷售模式的多樣化，必須 從傳統(tǒng)的渠道上逐漸往互聯(lián)網(wǎng)方向發(fā)展，積極借助新的技術(shù)和新的渠道，抓住時(shí)展的契機(jī)。
二、互聯(lián)網(wǎng)保險(xiǎn)發(fā)展中遇到的基本問題
（一）線上與線下結(jié)合比較弱
現(xiàn)階段來看，互聯(lián)網(wǎng)保險(xiǎn)僅僅限于簡(jiǎn)單的保險(xiǎn)品種，一些較為復(fù)雜的保險(xiǎn)品種，如護(hù)理保險(xiǎn)和人壽保險(xiǎn)等需要保險(xiǎn)工作人員進(jìn)行推銷和說明，一些金額比較大的理賠案例需要現(xiàn)場(chǎng)查勘。互聯(lián)網(wǎng)無法完全代替人工服務(wù)，國(guó)內(nèi)保險(xiǎn)行業(yè)產(chǎn)品基本上都圍繞著組織架構(gòu)而建立，因此使得傳統(tǒng)的保險(xiǎn)公司很難從組織結(jié)構(gòu)層面上做好互聯(lián)網(wǎng)保險(xiǎn)工作。
（二）創(chuàng)新保險(xiǎn)產(chǎn)品不多
互聯(lián)網(wǎng)保險(xiǎn)銷售目前以傳統(tǒng)保險(xiǎn)產(chǎn)品為主，創(chuàng)新型的 保險(xiǎn)產(chǎn)品不夠多。與此同時(shí)，互聯(lián)網(wǎng)保險(xiǎn)銷售受地區(qū)經(jīng)濟(jì)發(fā)展水平的影響比較深刻，地區(qū)經(jīng)濟(jì)發(fā)達(dá)水平高低直接影響著保險(xiǎn)工作人員是否能夠深度發(fā)掘消費(fèi)者 所需要的相關(guān)保險(xiǎn)產(chǎn)品，最終 使得保險(xiǎn)業(yè)務(wù)能夠精確到每一位客戶。
（三）創(chuàng)新商業(yè)模式比較薄弱
現(xiàn)階段來看 ，保險(xiǎn)企業(yè)主要是將互聯(lián)網(wǎng)作為一種銷售渠道，一旦沒有利用好互聯(lián)網(wǎng)模式，勢(shì)必會(huì)改變保險(xiǎn)業(yè)務(wù)的運(yùn)作模式，最終改變整個(gè)保險(xiǎn)行業(yè)的價(jià)值體系。保險(xiǎn)參與者沒有有效實(shí)現(xiàn)互聯(lián)網(wǎng)平臺(tái)的交流與溝通等，保險(xiǎn)公司僅僅通過服務(wù)化和精英化方式來完成保險(xiǎn)融合。
三、互聯(lián)網(wǎng)保險(xiǎn)的商業(yè)模式
（一）移動(dòng)互聯(lián)網(wǎng)銷售模式
移動(dòng)互聯(lián)網(wǎng)銷售模式主要利用的是手機(jī) 和平板電腦等設(shè)備提供相關(guān)服務(wù)。以國(guó)華人壽為代表的保險(xiǎn)公司推出了微信公眾服務(wù)憑條，相比起傳統(tǒng)的銷售渠道而言，移動(dòng)互聯(lián)網(wǎng)保險(xiǎn)具有更貼近客戶基本需求的優(yōu)勢(shì)；
（二）專業(yè)互聯(lián)網(wǎng)保險(xiǎn)企業(yè)模式
專業(yè)互聯(lián)網(wǎng)保險(xiǎn)企業(yè)通過專門設(shè)立的互聯(lián)網(wǎng)保險(xiǎn)企業(yè)來經(jīng)營(yíng)相關(guān)保險(xiǎn)業(yè)務(wù)，我國(guó)太平洋保險(xiǎn)和人壽保險(xiǎn)等公司紛紛成立了電子商務(wù)公司，繼而經(jīng)營(yíng)好互聯(lián)網(wǎng)保險(xiǎn)業(yè)務(wù)工作。即使專業(yè)互聯(lián)網(wǎng)保險(xiǎn)公司模式得到社會(huì)的關(guān)注，但是由于受到能力條件有限因素影響， 線上成交的運(yùn)營(yíng)模式在不斷地嘗試和探索中；
（三）官方網(wǎng)站模式
官方網(wǎng)站體現(xiàn)了網(wǎng)站主辦者的意志，具有權(quán)威作用?；ヂ?lián)網(wǎng)保險(xiǎn)的官方網(wǎng)站模式主要指的是保險(xiǎn)企業(yè)來展現(xiàn)保險(xiǎn)產(chǎn)品信息，提供在線服務(wù)工作。一些頗有實(shí)力的保險(xiǎn)企業(yè)更為注重品牌效應(yīng)，為具有品牌忠誠(chéng)度的客戶提供網(wǎng)上購(gòu)買的渠道，對(duì)產(chǎn)品的介紹也更為細(xì)致，用戶也能夠選擇到更適合自己的保險(xiǎn)產(chǎn)品。官方網(wǎng)站模式具有以下幾個(gè)方面的特點(diǎn)：其一，有利于在公眾面前樹立良好的企業(yè)形象；其二，有利于降低對(duì)第三方網(wǎng)站平臺(tái)的依賴；其三，有利于保險(xiǎn)企業(yè)的自身品牌推廣。
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篇3
[關(guān)鍵詞] 計(jì)算機(jī)軟件 源代碼 專利 著作權(quán)法與商業(yè)秘密法結(jié)合保護(hù)
一、軟件源代碼的技術(shù)特征和商業(yè)運(yùn)作機(jī)制
軟件是指揮計(jì)算機(jī)解決某問題而編寫的程序及相關(guān)文檔的總稱。計(jì)算機(jī)程序通常包括源程序和目標(biāo)程序,又稱源代碼和目標(biāo)代碼。源代碼是由開發(fā)者使用類似于自然語言和數(shù)學(xué)公式的高級(jí)語言或匯編語言,如C、Java、Basic、Fortran等編寫而成,可供技術(shù)人員閱讀、修改。而目標(biāo)代碼則是通過開發(fā)工具包將源代碼直接編譯,以0或1的二進(jìn)制編碼形式表示,能直接由計(jì)算機(jī)識(shí)別,操作并實(shí)現(xiàn)某項(xiàng)功能的程序。
從軟件行業(yè)的技術(shù)特征來看,計(jì)算機(jī)程序開發(fā)的過程,首先從開發(fā)人員的技術(shù)思想開始,而這種新的技術(shù)思想、結(jié)構(gòu)又需要,而且只能通過源代碼的編寫來實(shí)現(xiàn)。開發(fā)人員通常必須首先分析用戶的實(shí)際需要和技術(shù)要求,明確此項(xiàng)軟件最終應(yīng)當(dāng)實(shí)現(xiàn)的功能和用途,然后運(yùn)用自己的專業(yè)技術(shù)知識(shí),設(shè)計(jì)算法、確定結(jié)構(gòu),選擇一種或幾種最優(yōu)或最適合的高級(jí)程序設(shè)計(jì)語言。接著,利用該語言的開發(fā)工具包所提供的語言環(huán)境和語法格式編制源代碼,再利用工具包中自帶的翻譯程序?qū)⒁呀?jīng)編碼的源程序翻譯成目標(biāo)代碼,由計(jì)算機(jī)自動(dòng)識(shí)別和運(yùn)行。初次試運(yùn)行結(jié)束后,開發(fā)人員根據(jù)運(yùn)行的實(shí)際結(jié)果對(duì)源代碼進(jìn)行進(jìn)一步的修改和完善。如果初次運(yùn)行失敗,開發(fā)人員則需要使用調(diào)試功能查找問題,修改源代碼,再次投入翻譯和運(yùn)行。一個(gè)新程序開發(fā)成功往往需要多次試運(yùn)行并修改,直至得到最佳程序方案,方能將目標(biāo)代碼及用戶手冊(cè)提交用戶,投入使用。當(dāng)然,這其中也包含有軟件開發(fā)失敗,程序預(yù)期功能最終未能實(shí)現(xiàn)的風(fēng)險(xiǎn)。由此可見,軟件開發(fā)最關(guān)鍵的技術(shù)核心,在于確定技術(shù)方案,編制源代碼階段。源代碼具有可操作性、間接應(yīng)用性,直接反映了開發(fā)者的思想和結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì),決定了軟件的技術(shù)含量和智力水平。
從軟件行業(yè)的商業(yè)運(yùn)作機(jī)制來看,由于軟件從根本上說,僅僅是一種蘊(yùn)含著技術(shù)思想的工具,根本目的在于實(shí)現(xiàn)某一特定功能,對(duì)于終端用戶而言,其中所蘊(yùn)含的技術(shù)是不必也無需知道的,因?yàn)橹灰浍@得目標(biāo)代碼并在一定的環(huán)境下運(yùn)行,計(jì)算機(jī)就可以自動(dòng)識(shí)別并實(shí)現(xiàn)其所預(yù)期的技術(shù)功能,其所支付的購(gòu)買成本即可以得到償付。可以說,軟件銷售行業(yè)的商業(yè)運(yùn)行對(duì)普通終端用戶而言,僅僅是一種技術(shù)功能實(shí)現(xiàn)成本的交易。由于本身缺乏相應(yīng)的技術(shù)知識(shí)和背景,獲取源代碼并知悉其中的技術(shù)思想對(duì)普通的軟件消費(fèi)者而言毫無意義,如欲規(guī)避該功能實(shí)現(xiàn)成本,只需要非法復(fù)制該軟件的目標(biāo)代碼并在計(jì)算機(jī)上運(yùn)行即可。因此,一般情況下,軟件開發(fā)完畢之后,最終用戶只能獲得目標(biāo)代碼和用戶手冊(cè),除非有特殊約定或公開許可,源代碼是作為軟件開發(fā)者的商業(yè)秘密,不予提供。然而,誠(chéng)如上文所述,對(duì)于軟件開發(fā)行業(yè)來說,源代碼的地位卻是至關(guān)重要的,獲取了已有軟件的源代碼就可以輕易的獲知其中的技術(shù)思想和訣竅,并在此基礎(chǔ)上改進(jìn)開發(fā),或研究其漏洞,從而大大縮短原有的技術(shù)開發(fā)成本,研究出改進(jìn)、替代產(chǎn)品,并從中獲取商業(yè)利潤(rùn)。
二、軟件源代碼單一版權(quán)法保護(hù)的優(yōu)勢(shì)和不足
目前,除少數(shù)技術(shù)比較發(fā)達(dá)的國(guó)家允許純軟件專利(P21-22)之外,各國(guó)對(duì)計(jì)算機(jī)軟件主要采用版權(quán)法保護(hù)模式。無可否認(rèn),版權(quán)保護(hù)能成為當(dāng)今世界軟件立法的主流,必然有其內(nèi)在優(yōu)勢(shì)和可行性:首先,版權(quán)保護(hù)范圍廣泛。版權(quán)法對(duì)作品的創(chuàng)作水平要求較低,即所謂只須具有創(chuàng)造性火花(Creative Spark),而不必達(dá)到新穎的、完美的或巧妙的(Novel、Unique or Ingenious) (P24-25)。其次,版權(quán)自動(dòng)保護(hù)原則,使源代碼從編碼完成即受保護(hù),至多也只須進(jìn)行注冊(cè)登記,手續(xù)簡(jiǎn)便,成本低廉;最后,版權(quán)法保護(hù)范圍有限。只保護(hù)表達(dá),不保護(hù)創(chuàng)作思想,其他開發(fā)者可借鑒已有軟件的技術(shù)思想進(jìn)行創(chuàng)新和優(yōu)化。
然而,源代碼的技術(shù)性特征使得其不可能與傳統(tǒng)版權(quán)法所有理念和內(nèi)容完全吻合,國(guó)外有學(xué)者甚至認(rèn)為:“包含計(jì)算機(jī)程序會(huì)導(dǎo)致著作權(quán)制度的歪曲 (P77-78)”。
1. 傳統(tǒng)版權(quán)法的立法目的與源代碼功能技術(shù)性特征不符。
正如通產(chǎn)省1983年《程序法建議》所述,“版權(quán)法的宗旨是促進(jìn)文化發(fā)展,而軟件保護(hù)則主要在于促進(jìn)工業(yè)或其他產(chǎn)業(yè)的發(fā)展 (P100)”。日本1970年《著作權(quán)法》、韓國(guó)1987年《著作權(quán)法》及我國(guó)臺(tái)灣地區(qū)《著作權(quán)法》均在第一條開宗明義地規(guī)定,本法的目的是為促進(jìn)國(guó)家文化向上發(fā)展 (P1-2)。事實(shí)上,版權(quán)的產(chǎn)生和發(fā)展,源于人類對(duì)自身精神領(lǐng)域的關(guān)注,是對(duì)人類傳播思想、文化、藝術(shù),從閱讀、欣賞、評(píng)價(jià)中得到思想升華和精神愉悅的肯定。而源代碼則與此完全不同,其開發(fā)、編寫、內(nèi)容、表達(dá)都具有鮮明的實(shí)用目的和功能性用途,
2. 傳統(tǒng)版權(quán)法以文化作品為標(biāo)準(zhǔn)的概念和規(guī)則在源代碼領(lǐng)域不適用。
按照上述立法目的,傳統(tǒng)理論將版權(quán)保護(hù)的作品界定為“對(duì)文藝、學(xué)術(shù)、美術(shù)以及音樂范圍內(nèi)的思想及感情的創(chuàng)造性的表達(dá)” (P447)。而源代碼從產(chǎn)生時(shí)起,就是一種實(shí)用技術(shù)工具。雖然表達(dá)具有文字屬性,但僅用于轉(zhuǎn)換為機(jī)讀的指令序列,即由機(jī)器識(shí)別、執(zhí)行,這與傳統(tǒng)作品的作用大不相同。因此,有學(xué)者認(rèn)為,“程序本身幾乎沒有或根本沒有任何實(shí)際意義,其意義只有在計(jì)算機(jī)運(yùn)行的過程中才能顯示出來。因此,它作為作品的法律地位在某種程度上是無效的 (P204)”。
3. 傳統(tǒng)版權(quán)法思想――表達(dá)二分法的基本原則與源代碼的“雙重屬性”的沖突。
版權(quán)法僅保護(hù)富有創(chuàng)意的表達(dá),并不延及創(chuàng)意本身和技術(shù)功能,這已成為國(guó)際版權(quán)保護(hù)的共識(shí)。只要是非抄襲的獨(dú)立創(chuàng)作且表達(dá)方式有異,即使與已有作品思想雷同,亦符合版權(quán)原創(chuàng)性要求。然而,源代碼兼具表達(dá)與技術(shù)雙重屬性,其根本價(jià)值在于作者的技術(shù)構(gòu)思和功能性步驟設(shè)計(jì)。同時(shí),其表達(dá)的多樣性受到諸多限制。這就可能產(chǎn)生十分不合理的結(jié)果:一方面,某些基礎(chǔ)功能的最優(yōu)編碼方式可能僅有一種,保護(hù)此表達(dá),實(shí)際上就間接壟斷了該技術(shù)思想。另一方面,只要了解軟件源代碼的技術(shù)思想,再以不同的表達(dá)方式重新編寫,就能輕易規(guī)避版權(quán)保護(hù)。這一弊端,是軟件版權(quán)保護(hù)最易受攻擊的弱點(diǎn)。
另外,文學(xué)作品的版權(quán)保護(hù)期限較長(zhǎng),一般為作者終身加死后50年。而大多數(shù)軟件壽命較短,只有幾年使用時(shí)間。因此,50年的保護(hù)期對(duì)軟件而言意義不大。
三、軟件源代碼單一商業(yè)秘密法法保護(hù)的優(yōu)勢(shì)和不足
從一定意義上講,軟件的商業(yè)秘密保護(hù)是一種“收底”的保護(hù)方式,由于其具有很強(qiáng)的靈活性和主動(dòng)性,在保護(hù)軟件源代碼領(lǐng)域具有明顯優(yōu)勢(shì)。
1. 它滿足了權(quán)利人壟斷性權(quán)利與技術(shù)不公開的雙重要求,在避免專利理念沖突的同時(shí),保護(hù)了源代碼中的技術(shù)思想。
源代碼是軟件開發(fā)的技術(shù)核心,是開發(fā)人員最重要的智慧財(cái)富。對(duì)此,專利法無法逾越其公開要求,而版權(quán)法則對(duì)保護(hù)思想無能為力。商業(yè)秘密保護(hù)則正好彌補(bǔ)了二者的缺陷,它保護(hù)技術(shù)思想和功能,同時(shí)并不要求公開,甚至還特別要求權(quán)利人必須采取保密措施。這就滿足了權(quán)利人壟斷并不愿意公開技術(shù)的雙重要求。當(dāng)然,不公開技術(shù)也就相應(yīng)的無法享受專利法的絕對(duì)壟斷,商業(yè)秘密法保護(hù)的力度和效力較之專利法而言明顯較弱,然而事實(shí)上,這種相對(duì)弱勢(shì)的保護(hù)方式對(duì)于軟件業(yè)的技術(shù)革新而言是不無裨益的。
2. 其保護(hù)門檻低,保護(hù)力度和期限靈活,權(quán)利人有充分的自主性,非常適合軟件行業(yè)周期短,革新快,競(jìng)爭(zhēng)激烈的行業(yè)特征。
3. 對(duì)開發(fā)者未來潛在利益的保護(hù):首先,可以有效防止他人在其軟件基礎(chǔ)上進(jìn)行后續(xù)開發(fā)。其次,可以低成本壟斷技術(shù)及其更新,維護(hù)軟件產(chǎn)品的后續(xù)利益。如后期技術(shù)服務(wù)、漏洞補(bǔ)正、界面和擴(kuò)展性的完善等,微軟公司在操作系統(tǒng) Windows3.1的基礎(chǔ)上不斷推出Windows95、98、Professional及至Windows XP,就是最好例證。最后,可以維護(hù)軟件安全性,防止因源代碼泄露而被他人利用產(chǎn)品安全漏洞攻擊計(jì)算機(jī)網(wǎng)絡(luò)。
然而,單一商業(yè)秘密保護(hù)也存在弊端:首先,商業(yè)秘密法的保護(hù)力度有限,往往只能通過軟件銷售協(xié)議或雇用合同中的保密條款主張相關(guān)違約或侵權(quán)責(zé)任,或者依靠開發(fā)者自身的保密措施,難以達(dá)到令人滿意的效果。其次,商業(yè)秘密法無法禁止合法獲取秘密信息后完全復(fù)制和使用。商業(yè)秘密法只禁止對(duì)源代碼的非法獲取,不禁止“通過公平和誠(chéng)實(shí)的方法”獲取,按照TRIPS規(guī)定,主要指“公平誠(chéng)實(shí)的反向工程和獨(dú)立開發(fā)”。因此,若第三人破譯了權(quán)利人的技術(shù)保護(hù),用反向工程獲取源代碼,就有權(quán)對(duì)其進(jìn)行任何形式的使用,包括在新軟件中完全照搬,形成內(nèi)容和功能都完全相同的軟件。當(dāng)然,在現(xiàn)實(shí)生活中,這種原封不動(dòng)的照搬并無意義,因?yàn)楸I版目標(biāo)代碼即可達(dá)到同樣效果。事實(shí)是第三人往往以反向工程復(fù)制部分源代碼用于自己的軟件,產(chǎn)生功能有所差異的新軟件。對(duì)此,商業(yè)秘密法無能為力。
四、軟件源代碼版權(quán)與商業(yè)秘密保護(hù)的良性互補(bǔ)
在軟件保護(hù)領(lǐng)域,版權(quán)法與商業(yè)秘密法可否并存?對(duì)此,美國(guó)第二巡回上訴法院在“阿爾泰”一案中確認(rèn)了二者的并存及各自適用的范圍 (P18)?！笔聦?shí)上,“版權(quán)與商業(yè)秘密在軟件保護(hù)中建立了一種精妙的良性互動(dòng)關(guān)系,他們彼此間的支持與配合,既可以克服單一版權(quán)保護(hù)的‘先天不足’,又可以避免軟件專利保護(hù)的不當(dāng)。二者的結(jié)合,在不沖擊現(xiàn)有知識(shí)產(chǎn)權(quán)體系和符合社會(huì)公共政策目標(biāo)的同時(shí),為軟件業(yè),特別是軟件源代碼,提供了有效、正當(dāng)?shù)谋Ｗo(hù)(P50)”。
1. 商業(yè)秘密法保護(hù)側(cè)重于保護(hù)對(duì)象的內(nèi)容,兼顧了軟件源代碼的技術(shù)思想和文字表達(dá),實(shí)現(xiàn)了對(duì)源代碼雙重屬性的“雙重保護(hù)”,彌補(bǔ)了版權(quán)法的保護(hù)漏洞。
源代碼兼具表達(dá)的文字性和功能的技術(shù)性,其技術(shù)思想和結(jié)構(gòu)是開發(fā)人員最重要的智慧財(cái)富。但版權(quán)法受其立法目的所限,嚴(yán)格依照“思想―表達(dá)兩分法”界定保護(hù)范圍。商業(yè)秘密法則恰好兼顧了這種雙重要求:從立法目的上看,商業(yè)秘密保護(hù)關(guān)注的不在于表達(dá)本身,而在于表達(dá)信息的內(nèi)容;從保護(hù)對(duì)象上看,其既保護(hù)“表達(dá)”,也保護(hù)“思想”,任何采取不正當(dāng)手段或違約獲取和使用“信息”的行為都在禁止之列。這就滿足了權(quán)利人對(duì)軟件源代碼技術(shù)思想的關(guān)注,有效彌補(bǔ)了版權(quán)法保護(hù)的缺漏。同時(shí),商業(yè)秘密法保護(hù)期限、力度的靈活性也彌補(bǔ)了版權(quán)法保護(hù)期限和范圍僵化的不足。
2. 版權(quán)法則有效克服了商業(yè)秘密法保護(hù)的不足。商業(yè)秘密法無法解決的保護(hù)力度有限,無法防止合法取得而引發(fā)的復(fù)制和后續(xù)使用的問題完全可以用版權(quán)法來補(bǔ)充:一旦源代碼取得著作權(quán),就意味著即使合法獲得,對(duì)其進(jìn)行任何形式的復(fù)制和直接使用,甚至是非常類似的表達(dá)都將構(gòu)成侵權(quán)。
總之,在版權(quán)法和商業(yè)秘密法的結(jié)合保護(hù)體系下,版權(quán)自動(dòng)產(chǎn)生,不以權(quán)利人公開為條件,同時(shí),版權(quán)法并不禁止將同一作品的一種表現(xiàn)形式(源代碼)予以保密,而同時(shí)公開該作品的另一種形式(目標(biāo)代碼)。因此,權(quán)利人完全可以發(fā)行目標(biāo)代碼滿足普通用戶的使用,而將源代碼作為商業(yè)秘密嚴(yán)加保護(hù)。版權(quán)法和商業(yè)秘密法分別保護(hù)源代碼的“表達(dá)”和“思想”,各司其職,相互協(xié)調(diào)。
此時(shí),對(duì)源代碼的獲取和使用就存在以下四種情況:(1)若他人非法獲悉源代碼并進(jìn)行復(fù)制,則構(gòu)成對(duì)版權(quán)和商業(yè)秘密的雙重侵犯;(2)若其非法獲取源代碼,但僅閱讀并理解其中的結(jié)構(gòu)思想,未復(fù)制其表達(dá)(如,為發(fā)現(xiàn)漏洞編寫病毒程序),則只構(gòu)成對(duì)商業(yè)秘密的侵犯;(3)若其采用反向工程等合法手段突破權(quán)利人的保密措施獲取源代碼,并將其用于新軟件的編碼過程,則只構(gòu)成版權(quán)侵權(quán);(4)若其合法獲取源代碼后僅抽取其中的思想重新編碼,且不構(gòu)成與權(quán)利人源代碼的實(shí)質(zhì)相似,則不構(gòu)成侵權(quán)。
當(dāng)然,軟件源代碼的這種雙重保護(hù)體系,還需對(duì)版權(quán)法和商業(yè)秘密法本身進(jìn)行必要的修改和協(xié)調(diào),如擴(kuò)展版權(quán)法立法宗旨和對(duì)象,修改以傳統(tǒng)文化作品為標(biāo)準(zhǔn)的各項(xiàng)概念和規(guī)則以及滌清二者各自的適用范圍和具體內(nèi)容等。
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篇4
摘要：目的 研究烏飯樹樹葉及其提取物對(duì)視網(wǎng)膜免受光損傷的保護(hù)功能。方法 將20只新西蘭白兔分成4組：正常對(duì)照組和模型對(duì)照Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組。正常對(duì)照組動(dòng)物自由攝取飼料，自由飲水；模型對(duì)照Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組動(dòng)物除自由攝取飼料，自由飲水外，每天分別喂烏飯樹新鮮樹葉[50g/(kg?d)]、烏飯樹陳舊樹葉[50g/(kg?d)] 和烏飯樹樹葉提取物[50mg/(kg.d)]，連續(xù)4周。并且進(jìn)行強(qiáng)光刺激，同時(shí)利用視網(wǎng)膜電圖(ERG)進(jìn)行視網(wǎng)膜分析，最后處死白兔測(cè)定視網(wǎng)膜中丙二醛(MDA) 的含量和總超氧化物岐化酶(TSOD)的活力。結(jié)果 ERG測(cè)定結(jié)果發(fā)現(xiàn)，對(duì)照組B波的潛伏期時(shí)間延長(zhǎng)而振幅降低，模型組白兔ERG的變化趨勢(shì)正好相反。同時(shí)模型組視網(wǎng)膜中的MDA含量要低于對(duì)照組(P
關(guān)鍵詞：烏飯樹；提取物；視網(wǎng)膜；光損傷
The protective effect of Vaccinium Bracteatum Thunb leaves and the extract against light injury of retina
Wang Li， Zhang Xuetong， Yao Huiyuan
(School of Food Science and Technology， Southern Yangtze University， Wuxi 214036;Department of Ophthalmology of the Wuxi No.4 Peoples Hospital， Wuxi 214036， China)
ABSTRACT: Objective To investigate the protective effect of the extract of Vaccinium Bracteatum Thunb (VBT) leaves against light injury of retina. Methods 20 Newzealand rabbits were pided into 4 groups: the normal control group， modelⅠgroup， modelⅡ group， and model Ⅲ group. The normal control group ate and drank freely. modelⅠgroup ate and drank freely but took in 50g/(kg?d) fresh VBT leaves daily for 4 weeks. model Ⅱgroup ate and drank freely， but took in 50g/(kg?d) old VBT leaves daily for 4 weeks. model Ⅲ group ate freely， but took in 50mg/(kg?d) extract of VBT leaves(resolved in water) daily for 4 weeks. All rabbits were exposed to strong light， meanwhile， the retinas were analyzed by electroretinogram (ERG) every week. Finally， all the rabbits were killed and the content of MDA and SOD in the retina were detected. Results In the control group， the latency time of the B wave increased and the amplitude of the B wave shortened， while in the model Ⅰ，Ⅱ and Ⅲ groups， the changes of B wave just opposite. The content of MDA in the model Ⅰ，Ⅱ， and Ⅲ groups was lower than that in the control group(P
KEY WORDS: Vaccinium Bracteatum Thunb(VBT); extract; retina; light injury
烏飯樹是杜鵑花科的一種植物，我國(guó)南北各地均產(chǎn)，很多中藥類書籍中都記載其對(duì)人體具有保健作用[12]。國(guó)外對(duì)烏飯樹同種屬植物的果實(shí)進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，其對(duì)多種眼科疾病均有很好的治療效果，目前很多國(guó)家都已經(jīng)把烏飯樹紫黑漿果中提取出的色素類物質(zhì)用于眼科醫(yī)療領(lǐng)域。意大利、法國(guó)、西班牙、韓國(guó)、美國(guó)以及新西蘭等國(guó)家已經(jīng)將其應(yīng)用于夜盲癥、毛細(xì)管脆弱、腦血管障礙、胃潰瘍的治療[34]。本研究采用強(qiáng)光刺激損傷白兔視網(wǎng)膜，同時(shí)喂食烏飯樹樹葉或其提取物，利用視網(wǎng)膜電圖技術(shù)(electroretinogram， ERG)對(duì)白兔視網(wǎng)膜進(jìn)行研究，然后對(duì)視網(wǎng)膜進(jìn)行丙二醛(MDA)和超氧化物岐化酶(SOD)含量分析，最后對(duì)其保護(hù)機(jī)理進(jìn)行了初步的探討。
1 材料與方法
1.1 材料
1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 新西蘭大白兔20只，購(gòu)自江南實(shí)驗(yàn)動(dòng)物場(chǎng)，體重(2.5±0.5)kg。
1.1.2 藥品與試劑 烏飯樹樹葉，購(gòu)自于江蘇溧陽；烏飯樹樹葉提取物，實(shí)驗(yàn)室自制；美多麗眼液，參天制藥株氏會(huì)社(日)；倍諾喜眼液，參天制藥株氏會(huì)社(日)；總蛋白含量測(cè)試盒，購(gòu)自于南京建成生物研究所； MDA含量測(cè)定試劑盒，購(gòu)自于南京建成生物研究所； SOD活力測(cè)定試劑盒，購(gòu)自于南京建成生物研究所；PBS(磷酸鹽緩沖液)：800mL蒸餾水中溶解8g氯化鈉，0.2g氯化鉀，1.44g磷酸氫二鈉和0.24g磷酸二氫鉀，用鹽酸調(diào)節(jié)pH至7.4，加水定容至1L，在1.034×105Pa高壓下殺菌20min，保存于室溫。
1.1.3 主要儀器 全視野閃光刺激器，重慶醫(yī)用電子儀器廠；視覺電生理檢查與診斷系統(tǒng)VETSⅢB，重慶醫(yī)用電子儀器廠。
1.2 方法 20只新西蘭大白兔適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，自由攝取飼料，自由飲水。然后用1000W強(qiáng)光照射，刺激眼睛視網(wǎng)膜產(chǎn)生光損傷，同時(shí)按照不同的組別進(jìn)行喂養(yǎng)食物，每周進(jìn)行ERG的測(cè)量。具體分組如下：正常對(duì)照組：自由攝取飼料，自由飲水。模型對(duì)照Ⅰ組：自由攝取飼料，自由飲水，另外每天喂烏飯樹新鮮樹葉，按照50g/(kg?d)劑量喂養(yǎng)，連續(xù)4周。模型對(duì)照Ⅱ組：自由攝取資料，自由飲水，另外每天喂烏飯樹陳樹葉，按照50g/(kg?d)劑量喂養(yǎng)，連續(xù)4周。模型對(duì)照Ⅲ組：自由攝取飼料，另外每天喂烏飯樹樹葉提取物(溶解于飲水中)，按照50mg/(kg?d)劑量喂養(yǎng)，連續(xù)4周。
1.2.1 ERG的測(cè)量 記錄電極為角膜式接觸電極，參考電極和接地電極為普通電極。預(yù)先用剪刀剪去白兔額部毛，再用剃須刀刮干凈。進(jìn)行ERG測(cè)量操作前先用美多麗眼液對(duì)白兔進(jìn)行擴(kuò)瞳，暗適應(yīng)30min，眼角膜用倍諾喜進(jìn)行麻醉。分別利用藍(lán)光、白光和紅光對(duì)白兔視網(wǎng)膜進(jìn)行刺激(在白光刺激后明適應(yīng)30min再進(jìn)行紅光刺激測(cè)定)。記錄電極置于兔子眼角膜表面，參考電極置于靠近兔子額部，用膠布固定，接地電極置于兔子耳朵上，用膠布固定。測(cè)量時(shí)，兔子頭部置于刺激球中央，對(duì)單只眼睛視網(wǎng)膜進(jìn)行刺激。刺激條件：高頻85Hz，低頻0.1Hz，刺激光亮度1.5Log，單次刺激。記錄儀進(jìn)行同步記錄，經(jīng)過儀器分析得到B波的延滯時(shí)間(以ms為單位)和振幅(以μV為單位)，進(jìn)行分析。
1.2.2 視網(wǎng)膜勻漿的制備 于實(shí)驗(yàn)30d后將白兔處死，摘除眼球，仔細(xì)去除眼內(nèi)容物，剝離視網(wǎng)膜，置于冰冷的玻璃勻漿器中，冰浴下碾磨5min，制成勻漿，10000r/min高速離心15min，取上清液待用。
1.2.3 總蛋白含量的測(cè)定 蛋白質(zhì)上的氨基(-NH3+)與考馬斯亮蘭染料上的陰離子結(jié)合，能夠使溶液從棕紅色變?yōu)樗{(lán)色，通過測(cè)定吸光度值可以計(jì)算出其中的蛋白質(zhì)含量。取組織勻漿50μL，按照試劑盒配制試劑，并且進(jìn)行測(cè)量。
1.2.4 MDA的測(cè)定 過氧化脂質(zhì)的分解產(chǎn)物-MDA與硫代巴比妥酸作用后形成紅色物質(zhì)，利用分光光度計(jì)測(cè)定吸光度，可以計(jì)算出其中的丙二醛含量。按照試劑盒配制試劑，并且進(jìn)行測(cè)量。
1.2.5 總超氧化物岐化酶(TSOD)活力的測(cè)定 通過黃嘌呤以及黃嘌呤氧化酶反應(yīng)體系產(chǎn)生超氧陰離子自由基[O-2?]，氧化羥胺形成亞硝酸鹽，在顯色劑的作用下呈現(xiàn)紫紅色，當(dāng)樣品體系中含有SOD時(shí)，則對(duì)[O-2?]有專一性的抑制作用，使形成的亞硝酸鹽減少，比色時(shí)測(cè)定管的吸光度值要低于對(duì)照管的吸光度，通過計(jì)算可以得出視網(wǎng)膜中SOD的活力。按照試劑盒配制試劑并且測(cè)量。
2 結(jié)果
2.1 ERG測(cè)定結(jié)果 ERG分別由PⅠ、PⅡ和PⅢ三個(gè)導(dǎo)程構(gòu)成，B波是ERG中屬于其中的PⅡ?qū)С滩糠?，緊隨A波后的一個(gè)正相波。它起源于光感受器與神經(jīng)節(jié)細(xì)胞之間的神經(jīng)通路中的一種光興奮活動(dòng)，可能來自雙極細(xì)胞或Müller細(xì)胞。它反映視網(wǎng)膜內(nèi)核層區(qū)域細(xì)胞的電活動(dòng)，并且反應(yīng)非常迅速，受外界因素的影響較為明顯，如缺氧、溫度變化以及不同的光刺激等，因此B波作為評(píng)價(jià)視網(wǎng)膜功能可靠而靈敏的客觀指標(biāo)之一，近年來越來越受到重視。在本研究中測(cè)定白兔在受強(qiáng)光刺激后暗視ERG、暗反應(yīng)最大波和明視ERG中B波的變化。在實(shí)驗(yàn)中采用三種光(藍(lán)光、白光、紅光)對(duì)白兔視網(wǎng)膜進(jìn)行刺激，其中藍(lán)光測(cè)定值代表的是暗視ERG，白光測(cè)定值代表的是暗反應(yīng)最大波，而紅光測(cè)定值代表的是明視ERG。具體結(jié)果見表1-3。
2.2 白兔眼睛視網(wǎng)膜抗氧化指標(biāo)的檢測(cè)結(jié)果 實(shí)驗(yàn)30d后，將白兔的視網(wǎng)膜取出，進(jìn)行適當(dāng)?shù)奶幚?，測(cè)定其中的MDA和TSOD含量，前者可以反映視網(wǎng)膜脂質(zhì)過氧化的程度，而后者則反映其中抗氧化酶體系活力的變化。具體結(jié)果見表4。
表1 白兔暗適應(yīng)ERG――B波的潛伏期及振幅的變化（略）
Table 1 The change of the latency time and the amplitude of the B wave of the dark adaptation ERG of the rabbits
Model Ⅰ：fed with fresh leaves; Model Ⅱ: fed with leaves stored for one year; Model Ⅲ: fed with the extracts from leaves
*P
表2 白兔暗反應(yīng)最大波――B波的潛伏期及振幅的變化（略）
Table 2 The change of the latency time and the amplitude of the B wave of the scotopic threshold response of the rabbits
Model Ⅰ：fed with fresh leaves ; Model Ⅱ:fed with leaves stored for one year; Model Ⅲ:fed with the extracts from leaves
*P
表3 白兔明視ERG――B波的潛伏期及振幅的變化（略）
Table 3 The change of the latency time and the amplitude of the B wave of the photopic ERG of the rabbits
Model Ⅰ: fed with fresh leaves; Model Ⅱ:fed with leaves stored for one year; Model Ⅲ: fed with the extracts from leaves
*P
表4 不同實(shí)驗(yàn)組別白兔眼睛視網(wǎng)膜抗氧化酶體系的檢測(cè)結(jié)果（略）
Table 4 The contents of the MDA and SOD in the retina of different groups
Model Ⅰ: fed with fresh leaves; Model Ⅱ: fed with leaves stored for one year; Model Ⅲ: fed with the extracts from leaves
*P
3 討論
從表1-3中可以看出，隨著實(shí)驗(yàn)時(shí)間的延長(zhǎng)，對(duì)照組B波的潛伏期逐漸延長(zhǎng)，而模型組(Ⅰ-Ⅲ)則都在一定程度上有所降低，而B波振幅的變化趨勢(shì)正好相反。
由于視桿細(xì)胞對(duì)藍(lán)光敏感，因此暗視藍(lán)光ERG主要反映的是眼睛視網(wǎng)膜中視桿細(xì)胞的變化。從表1中的變化趨勢(shì)可以看出，烏飯樹樹葉和其提取物對(duì)視桿細(xì)胞具有明顯的改善作用。
視錐細(xì)胞對(duì)紅光敏感，所以明視ERG主要反映的是眼睛視網(wǎng)膜中視錐細(xì)胞的變化。從表2中的變化趨勢(shì)可以看出，烏飯樹樹葉和其提取物對(duì)視錐細(xì)胞同樣具有明顯的改善作用。
暗反應(yīng)最大波是視網(wǎng)膜明視系統(tǒng)和暗視系統(tǒng)的混合反映，其中的B波是視桿細(xì)胞興奮后產(chǎn)生的電位變化，可能起源于Müller細(xì)胞或雙極細(xì)胞。其反映視網(wǎng)膜內(nèi)核層區(qū)域細(xì)胞的電活動(dòng)，取決于視網(wǎng)膜內(nèi)信號(hào)傳遞過程的完整性[5]。從表3可以看出，烏飯樹樹葉和其提取物對(duì)于視網(wǎng)膜的視覺系統(tǒng)有很強(qiáng)的維護(hù)作用。
從表1-3還可以看出新鮮樹葉和陳樹葉對(duì)于視網(wǎng)膜的保護(hù)作用基本一致，說明在新鮮樹葉儲(chǔ)藏期間沒有功能性物質(zhì)的損失，或者是損失很少，這樣也就可以為原料的儲(chǔ)藏提供了一些依據(jù)。
MDA是脂質(zhì)過氧化的產(chǎn)物，通常被用來衡量脂質(zhì)過氧化的程度。視網(wǎng)膜的視細(xì)胞外節(jié)主要是盤膜結(jié)構(gòu)，內(nèi)含豐富的長(zhǎng)鏈多不飽和脂肪酸，在受到光的作用后，易從位于兩個(gè)雙鍵之間的亞甲基上脫去氫原子，形成質(zhì)子自由基，然后發(fā)生雙鍵和未配對(duì)電子位置的轉(zhuǎn)移，形成較穩(wěn)定的共軛雙鍵，再與氧反應(yīng)，形成質(zhì)子自由基和質(zhì)子過氧化物。這些自由基再攻擊其他不飽和脂肪酸，引起連鎖反應(yīng)，從而使盤膜以及線粒體膜和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜的脂類受到損害。
環(huán)境光的損傷被認(rèn)為是一種光化學(xué)損傷。感光器外段富含長(zhǎng)鏈不飽和脂肪酸，內(nèi)段富含線粒體，對(duì)氧的需求大，當(dāng)光子被視紫紅質(zhì)吸收后可產(chǎn)生一系列的自由基，它們與感光器和視網(wǎng)膜色素上皮(RPE)中的不飽和脂肪酸發(fā)生反應(yīng)，發(fā)生脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，引起眼睛組織破壞。從表4中可以看出，對(duì)照組的白兔眼睛視網(wǎng)膜中MDA的量大大超過正常白兔眼睛視網(wǎng)膜中的量[6]，說明實(shí)驗(yàn)中的強(qiáng)光刺激對(duì)白兔眼睛有了很嚴(yán)重的損傷；而模型組Ⅰ-Ⅲ的白兔視網(wǎng)膜中的MDA含量接近于正常白兔眼睛視網(wǎng)膜中的量，說明白兔食用烏飯樹樹葉或樹葉提取物后，視網(wǎng)膜內(nèi)部的脂質(zhì)過氧化得到了有效的抑制。其主要原因應(yīng)該是由于烏飯樹樹葉含有豐富的黃酮類物質(zhì)[4]，黃酮類物質(zhì)具有很強(qiáng)的清除自由基能力，而視網(wǎng)膜光化學(xué)損傷的主要發(fā)病機(jī)制是脂質(zhì)體過氧化[7]，所以在實(shí)驗(yàn)中服用烏飯樹樹葉或其提取物的白兔視網(wǎng)膜受到很好的保護(hù)。
視細(xì)胞中含有大量的線粒體，其中的呼吸鏈在進(jìn)行電子傳遞時(shí)可產(chǎn)生自由基，如輔酶Q是醌類化合物，通過氧化還原可生成半醌自由基。視細(xì)胞中的視黃醛或視黃醇受可見光照時(shí)也可產(chǎn)生自由基。許多研究表明，視網(wǎng)膜的光損傷是光照激發(fā)產(chǎn)生自由基，引起組織發(fā)生過氧化的結(jié)果。在正常情況下，機(jī)體內(nèi)自由基的產(chǎn)生與清除過程處于動(dòng)態(tài)平衡，在遭受各種外界因素的影響時(shí)，平衡被破壞，機(jī)體受損。視網(wǎng)膜本身具有一定的抗氧化能力，在一定程度上可以預(yù)防光化學(xué)損傷。它各層均存在清除自由基的天然保護(hù)系統(tǒng)，包括抗過氧化物酶和自然抗氧化劑[8]，它們可以通過各種化學(xué)反應(yīng)而終止自由基鏈反應(yīng)，達(dá)到清除有害自由基，防止組織破壞的目的。從表4可以看出，對(duì)照組白兔眼睛視網(wǎng)膜中SOD要遠(yuǎn)低于其他3個(gè)模型組，說明烏飯樹樹葉以及其提取物能夠有效地保護(hù)視網(wǎng)膜中的SOD，使其能夠保持活性。視網(wǎng)膜抗氧化能力下降時(shí)，容易受到光的損傷，反之在受到光的刺激損傷后，視網(wǎng)膜中的抗氧化酶體系必定發(fā)生變化。從表4可以看出，對(duì)照組的白兔眼睛視網(wǎng)膜中SOD的量大大低于正常白兔眼睛視網(wǎng)膜中的量[6]。有實(shí)驗(yàn)表明，光照可以使細(xì)胞內(nèi)SOD水平下降[9]，而SOD是生物體內(nèi)自由基清除劑之一，可以促進(jìn)超氧化物陰離子自由基的岐化反應(yīng)。在本研究中可能的機(jī)理是烏飯樹樹葉及其提取物能夠?qū)⒊蹶庪x子自由基[O-2?]轉(zhuǎn)變?yōu)镺2和H2O，清除其毒性作用，減輕和防止過氧化，從而達(dá)到保護(hù)視網(wǎng)膜的作用。同時(shí)，從表4可以得出結(jié)論，新鮮樹葉和陳樹葉可以達(dá)到基本一致的效果。
綜上所述，烏飯樹是一種很豐富的天然資源，其功能在很多中藥典籍中都有記載，但是目前的應(yīng)用不是很廣泛，原因是人們對(duì)它的功能和具體的作用機(jī)理不了解。本研究發(fā)現(xiàn)烏飯樹樹葉或其提取物能夠有效地預(yù)防保護(hù)視網(wǎng)膜免受光損傷，服用50g/(kg?d)的烏飯樹樹葉或者50mg/(kg?d)的提取物，可以起到明顯的效果。
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篇5
【摘要】 目的: 探討腹腔注射銀杏葉提取物（Ginkgo biboba extract，EGb 761）對(duì)豚鼠視神經(jīng)橫斷傷后視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞（retinal ganglion cell， RGC）形態(tài)及功能的保護(hù)作用。方法: 75只白化豚鼠隨機(jī)等分為正常對(duì)照組、假手術(shù)組、模型組、生理鹽水組和EGb 761組。分離暴露豚鼠的右眼視神經(jīng)并于球后1.0 mm處進(jìn)行橫斷造模，正常對(duì)照組不作任何處理，假手術(shù)組僅分離暴露視神經(jīng)。生理鹽水組和EGb 761組分別于實(shí)驗(yàn)開始前1周每日腹腔注射1次相應(yīng)體積生理鹽水和EGb 761（100 mg/kg），術(shù)后繼續(xù)給藥4周。術(shù)后第4天，各組隨機(jī)處死3只豚鼠，采用脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的dUTP缺口末端標(biāo)記(terminal deoxynucleotidyl transferasemediated deoxyuridine triphosphatebiotin nick endlabeling， TUNEL)法檢測(cè)RGC凋亡；分別于術(shù)后第14和28天進(jìn)行圖形視網(wǎng)膜電圖（pattern electoretinogram， PERG）檢查；摘取眼球作組織病理學(xué)檢查并計(jì)數(shù)視網(wǎng)膜垂直經(jīng)線RGC數(shù)目。結(jié)果: 術(shù)后第4天，正常對(duì)照組、假手術(shù)組和EGb 761組均未見TUNEL陽性RGC，模型組和生理鹽水組均見有TUNEL陽性RGC。術(shù)后第14和28天，模型組和生理鹽水組RGC數(shù)目均少于正常對(duì)照組和假手術(shù)組（P
【關(guān)鍵詞】 銀杏葉提取物; 視神經(jīng)損傷; 視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞; 圖形視網(wǎng)膜電圖; 神經(jīng)保護(hù); 豚鼠
Objective: To investigate the effects of Ginkgo biloba extract (EGb 761) on the morphology and function of retinal ganglion cells (RGC) in guinea pigs with optic nerve transection.
Methods: Seventyfive albino guinea pigs were randomly pided into five groups: normal control group， shamoperated group， untreated group， normal saline group and EGb 761 group. No operation was performed in the normal control group. Optic nerve was merely exposed in the shamoperated group， but transected at 1.0 mm from posterior pole of the eye ball in the untreated， normal saline and EGb 761 groups. Guinea pigs in the EGb 761 group or the normal saline group received daily intraperitoneal injection of EGb 761 (100 mg/kg) or corresponding volume of normal saline from 7 days before experiment to 28 days after experiment. Three guinea pigs in each group were sacrificed for apoptosis assay (TUNEL method) of RGC. Pattern electoretinograms (PERGs) were recorded 14 and 28 days after transection， respectively. At the end of the examination， six guinea pigs were killed for histological examination and RGC count.
Results: No TUNELpositive cells were observed in the normal control， shamoperated and EGb 761 groups， but there were TUNELpositive cells in the untreated group and the normal saline group. The numbers of RGCs in the untreated and normal saline groups were less than those in the normal control and shamoperated groups at 14 days or 28 days (P
Conclusion: EGb 761 can inhibit the apoptosis of RGCs in guinea pigs after optic nerve transection， thus protect the morphology and function of RGCs.
Keywords: Ginkgo biloba extract; optic nerve lesion; retinal ganglion cell; pattern electroretinogram; neuroprotective effect; guinea pigs
青光眼是一種威脅視神經(jīng)視覺功能，主要與眼壓升高有關(guān)的眼病，也是目前我國(guó)第二大致盲眼病。雖然青光眼的具體發(fā)病機(jī)制尚不清楚，但目前一致認(rèn)為視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞（retinal ganglion cell， RGC）凋亡為青光眼神經(jīng)損害的中心環(huán)節(jié)。研究證明銀杏葉提取物（Ginkgo biloba extract，EGb 761）具有抗氧化［1］、抗缺血［2］、保護(hù)線粒體［3］和抑制一氧化氮合酶活性［4］等廣泛的生物學(xué)效應(yīng)。因此，我們采用橫斷豚鼠球后視神經(jīng)的方法建立RGC損傷模型觀察EGb 761對(duì)RGC結(jié)構(gòu)的保護(hù)作用，并采用圖形視網(wǎng)膜電圖（pattern electroretinogram， PERG）評(píng)價(jià)EGb 761對(duì)RGC功能的保護(hù)作用。
1 材料和方法
1.1 實(shí)驗(yàn)材料
1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 75只雌性白化豚鼠，體質(zhì)量190～210 g，購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，許可證號(hào)為SCXK（滬）2007005。
1.1.2 實(shí)驗(yàn)藥物及試劑 EGb 761，17.5 mg/支（5 mL），批號(hào)為9941209C，德國(guó)威瑪舒培博士大藥廠產(chǎn)品；速眠新Ⅱ注射液，又名846合劑，1 mg/mL，軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院軍事獸醫(yī)研究所產(chǎn)品，批號(hào)為(2004)005013；陸醒寧注射液，1 mg/mL，軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院軍事獸醫(yī)研究所產(chǎn)品，批號(hào)為(2006)006011；甲基纖維素，上海建華精細(xì)生物制品有限公司產(chǎn)品；脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的dUTP缺口末端標(biāo)記（terminal deoxynucleotidyl transferasemediated deoxyuridine triphosphatebiotin nick endlabeling， TUNEL）檢測(cè)試劑盒，美國(guó)Promega公司產(chǎn)品；碘化丙啶（propidium iodide，PI），美國(guó)Sigma公司產(chǎn)品。
1.1.3 實(shí)驗(yàn)設(shè)備 手術(shù)顯微鏡（SM2000J，上海軼德醫(yī)療設(shè)備有限公司）；PERG檢查儀(EP1000，日本Tomey公司)；熒光顯微鏡（Axioplan 2，德國(guó)Zeiss公司）；光學(xué)顯微鏡（Olympus BX50，日本Olympus公司）。
1.2 實(shí)驗(yàn)方法
1.2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組 豚鼠使用嚴(yán)格遵循視覺與眼科研究協(xié)會(huì)（Association for Research in Vision and Ophthalmology， ARVO）有關(guān)視覺和眼科研究動(dòng)物使用條款。所有豚鼠均在12 h明/12 h暗，溫度為22～25 ℃，濕度為55%～60%的環(huán)境中飼養(yǎng)。采用計(jì)算機(jī)隨機(jī)數(shù)字法將75只豚鼠分為5組：正常對(duì)照組、假手術(shù)組、模型組、模型+生理鹽水組（生理鹽水組）、模型+EGb 761組（EGb 761組），每組15只。每只鼠的右眼為實(shí)驗(yàn)眼，左眼為用于計(jì)算RGC存活指數(shù)的對(duì)照眼。
1.2.2 視神經(jīng)橫斷方法 按照Nakazawa等［5］報(bào)道的方法進(jìn)行視神經(jīng)橫斷，建立豚鼠視神經(jīng)橫斷模型。臀部注射速眠新Ⅱ注射液0.6 mL/kg麻醉后，在手術(shù)顯微鏡下剪開外眥角；自12∶00處沿角膜緣逆時(shí)針呈180°打開球結(jié)膜并向后鈍性分離暴露視神經(jīng)，鈍性分離視神經(jīng)鞘表面的血管后于球后1.0 mm處橫斷球后視神經(jīng)。分別縫合球結(jié)膜和外眥角，涂金霉素眼膏。手術(shù)結(jié)束后立即在臀部注射陸醒寧（1.2 mL/kg）催醒。術(shù)中盡可能鈍性分離血管以不影響眼球的血液供應(yīng)，同時(shí)盡可能減少對(duì)視神經(jīng)的牽拉。
1.2.3 各組處理方法 正常對(duì)照組：不給任何處理；假手術(shù)組：按造模方法暴露視神經(jīng)，但不橫斷；模型組：按上述視神經(jīng)橫斷方法橫斷視神經(jīng)；生理鹽水組：于實(shí)驗(yàn)前7 d腹腔注射生理鹽水，每日1次，體積參照EGb 761的劑量，視神經(jīng)橫斷后繼續(xù)注射28 d；EGb 761組：于實(shí)驗(yàn)前7 d腹腔注射EGb 761，劑量為100 mg/kg［6］，每日1次，持續(xù)至視神經(jīng)橫斷后繼續(xù)注射28 d。視神經(jīng)橫斷后第4天，各組隨機(jī)處死3只豚鼠，摘取眼球作石蠟切片，進(jìn)行RGC凋亡的TUNEL標(biāo)記檢測(cè)。分別于視神經(jīng)橫斷后14 d和28 d進(jìn)行PERG檢查，檢查后每組處死6只豚鼠作視網(wǎng)膜組織病理學(xué)檢查，并作RGC計(jì)數(shù)。
1.2.4 TUNEL檢測(cè)RGC凋亡 按TUNEL檢測(cè)試劑盒說明書提供的方法進(jìn)行石蠟切片和常規(guī)脫蠟。用蛋白酶K孵育后滴加TUNEL反應(yīng)混合液，最后用PI襯染細(xì)胞核。經(jīng)上述處理后，在熒光顯微鏡下進(jìn)行觀察并采用AxioVision軟件進(jìn)行同步圖像采集，視網(wǎng)膜組織中凋亡的RGC細(xì)胞核呈黃色熒光著色。
1.2.5 組織學(xué)檢查及RGC存活指數(shù)計(jì)算 分別于造模后第14和28天采用速眠新Ⅱ注射液(0.6 mL/kg)腹腔注射麻醉后，按我們以往的方法［7］，在角膜緣12∶00位縫線作標(biāo)記并摘取眼球固定于10%甲醛液中，眼球摘除后再注射過量麻藥處死。眼球固定24 h后沿12∶00至6∶00經(jīng)線并沿視神經(jīng)中央對(duì)剖開眼球，棄去晶狀體和玻璃體，保留眼球壁。常規(guī)脫水、包埋、連續(xù)切片（3張）、蘇木素伊紅染色、封片。在光學(xué)顯微鏡下，從12∶00至6∶00鋸齒緣（經(jīng)視盤中央），計(jì)數(shù)整個(gè)經(jīng)線上RGC核的數(shù)目，以其左眼作對(duì)照計(jì)算RGC的存活指數(shù)［8］，每眼計(jì)數(shù)3張，取其平均值。計(jì)算公式：存活指數(shù)=（右眼垂直經(jīng)線RGC數(shù)目/左眼垂直經(jīng)線RGC數(shù)目）×100%。
1.2.6 PERG記錄方法 按BenShlomo等［9］報(bào)道的方法記錄PERG。采用日本Tomey系統(tǒng)，軟件為EP1000 Vision 1.2.3，刺激方式為棋盤格，刷新頻率為65 Hz，通頻帶設(shè)為5～100 Hz，平均疊加次數(shù)30～60次，取樣頻率為2 000 Hz，刺激間隔時(shí)間為338 ms。豚鼠在自然光適應(yīng)狀態(tài)下，用速眠新Ⅱ注射液麻醉后固定于一個(gè)可以三維移動(dòng)的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)臺(tái)上（自制）。記錄電極為環(huán)形氯化銀電極，滴加14 mg/mL甲基纖維素后固定于右眼角膜緣處，不銹鋼針制作的參考電極和地極，分別置于被檢眼同側(cè)顳側(cè)皮下和背部。豚鼠的角膜緣與熒光屏平行，角膜頂點(diǎn)與刺激野中心距離為20 cm，然后于明適應(yīng)狀態(tài)下記錄。每眼記錄3次以上，取其平均值。按照國(guó)際臨床視覺電生理學(xué)會(huì)（International Society for Clinical Electrophysiology of Vision， ISCEV）推薦的方法從P50的波峰至N95的波谷測(cè)量N95振幅［10］。
1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 所有數(shù)據(jù)采用x±s表示。采用SAS 6.12統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行單因素方差分析，如差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，則進(jìn)行各組均數(shù)間兩兩比較（StudentNewmanKeuls test， SNK）；RGC數(shù)目和P50波振幅相關(guān)性檢測(cè)采用直線相關(guān)分析。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。
2 結(jié)果
2.1 EGb 761對(duì)RGC凋亡的影響 凋亡細(xì)胞的細(xì)胞核在3通道激發(fā)光下呈綠色熒光著染，所有細(xì)胞核在5通道激發(fā)光下呈紅色熒光著染，在8通道激發(fā)光下凋亡細(xì)胞的細(xì)胞核呈黃綠色或黃色熒光著染。正常對(duì)照組和假手術(shù)組視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層均未見黃色熒光著染的RGC。模型組和生理鹽水組均見有較多強(qiáng)熒光著染的RGC。EGb 761組未見熒光著染的RGC。見圖1。
2.2 光學(xué)顯微鏡觀察 豚鼠視網(wǎng)膜可見清晰的10層組織學(xué)結(jié)構(gòu)，但全層無血管樣結(jié)構(gòu)。正常對(duì)照組神經(jīng)纖維層較厚，RGC呈立方形，排列緊密，胞漿豐富，核飽滿，染色較均勻，而膠質(zhì)細(xì)胞胞體較小，核深染。假手術(shù)組除RGC略為稀疏外，與正常對(duì)照組無明顯差異。視神經(jīng)橫斷后28 d，模型組和生理鹽水組RGC的數(shù)目明顯減少，神經(jīng)纖維層明顯變薄且RGC稀少，胞體變小。EGb 761組RGC胞體與正常大小無明顯區(qū)別，但數(shù)目略少。見圖2。
2.3 EGb 761對(duì)RGC存活指數(shù)的影響 正常豚鼠視網(wǎng)膜垂直經(jīng)線上RGC的數(shù)目為（318±13）個(gè)。視神經(jīng)橫斷后14 d時(shí)，模型組與生理鹽水組RGC存活指數(shù)顯著低于正常對(duì)照組和假手術(shù)組（P
圖1 TUNEL檢測(cè)EGb 761對(duì)RGC凋亡的影響（熒光顯微鏡，×400）（略）
Figure 1 Effects of EGb 761 on RGC apoptosis checked by TUNEL (Fluorescein microscopy， ×400)
GCL: Ganglion cell layer; INL: Inner nuclear layer; ONL: Outer nuclear layer; TUNEL: DeadEnd fluorometric terminal deoxynucleotidyl transferasemediated deoxyuridine triphosphatebiotin nick endlabeling; PI: Propidium iodide. A: Normal control group， no TUNEL positive RGCs; B: Shamoperated group， no TUNELpositive RGCs in retina; C: Untreated group， a few TUNEL positive RGCs (white arrows) presented in retina; D: Normal saline group， a few TUNELpositive RGCs (white arrows) presented in retina; E: EGb 761 group， no TUNELpositive RGCs presented in retina.
圖2 HE染色觀察EGb 761對(duì)視網(wǎng)膜組織結(jié)構(gòu)的影響 (光學(xué)顯微鏡，×400)（略）
Figure 2 Effects of EGb 761 on retinal structure observed by HE staining (Light microscopy， ×400)
GCL: Ganglion cell layer; INL: Inner nuclear layer; ONL: Outer nuclear layer. A: Normal control group. There was no vascular structure in retina， and cubic RGCs arrayed regularly and the nerve fibers layer (NFL) of retina was thick. B: Shamoperated group. The number of RGCs was close to that in normal control group. C: Untreated group. The number of RGCs and the thickness of NFL were obviously less than those in normal control group. D: Normal saline group. RGCs were rare and NFL was very thin. E: EGb 761 group. The number of RGCs and the NFL were slightly less than those in normal control group. All cells white arrows pointed at were RGCs.
圖3 視神經(jīng)橫斷后14和28 d各組RGC存活指數(shù)（略）
Figure 3 Survival index of RGC in each group 14 and 28 days after optic nerve transection
A: Normal control group; B: Shamoperated group; C: Untreated group; D: Normal saline group; E: EGb 761 group. Data were represented as x±s， n=6. *P
2.4 EGb 761對(duì)PERG N95振幅的影響 視神經(jīng)橫斷14 d時(shí)模型組和生理鹽水組N95振幅下降，顯著低于正常對(duì)照組、假手術(shù)組和EGb 761組（P0.05）。視神經(jīng)橫斷28 d時(shí)模型組和生理鹽水組N95振幅進(jìn)一步下降，顯著低于正常對(duì)照組、假手術(shù)組和EGb 761組（P0.05）。見圖4和圖5。
2.5 N95振幅與RGC存活指數(shù)的相關(guān)性 對(duì)N95振幅和RGC的存活指數(shù)進(jìn)行相關(guān)分析，結(jié)果為N95振幅與RGC的存活指數(shù)呈正相關(guān)關(guān)系，相關(guān)系數(shù)r為0.858 68（P=0.001 5）。見圖6。
圖4 視神經(jīng)橫斷后14和28 d各組N95 振幅的變化（略）
Figure 4 Changes of N95 amplitude in each group 14 and 28 days after optic nerve transection
A: Normal control group; B: Shamoperated group; C: Untreated group; D: Normal saline group; E: EGb 761 group. Data were represented as x±s， n=6. *P
圖5 視神經(jīng)橫斷后28 d各組PERG波形（略）
Figure 5 PERG wave form in each group 28 days after optic nerve transection
N35: Negative wave 35; P50: Positive wave 50; N95: Negative wave 95. A: Normal control group; B: Shamoperated group; C: Untreated group; D: Normal saline group; E: EGb 761 group.
圖6 N95振幅與RGC存活指數(shù)的相關(guān)關(guān)系（略）
Figure 6 Correlation of N95 amplitude with survival index of RGC
3 討論
EGb 761主要含有黃酮苷（24%）和萜類內(nèi)酯（6%）兩種成分。黃酮類化合物主要有槲皮素、山奈黃素、異鼠李素。萜類內(nèi)酯除銀杏內(nèi)酯外還有銀杏苦內(nèi)酯A、B、C和J。該制劑可抗脂質(zhì)過氧化，對(duì)缺血和（或）缺氧損傷、機(jī)械損傷的神經(jīng)元具有保護(hù)作用。它能減輕谷氨酸毒性，抑制血小板凝集，對(duì)抗凋亡，還能使眼動(dòng)脈血流量增加。本研究結(jié)果證明EGb 761能抑制視神經(jīng)橫斷后RGC凋亡，對(duì)RGC有保護(hù)作用，該結(jié)果與Hirooka等［11］的研究結(jié)果一致。
PERG是客觀評(píng)價(jià)RGC功能的方法之一，其波形主要特征為一個(gè)正向的P50波和一個(gè)向下的N95波。根據(jù)各種疾病PERG的不同表現(xiàn)，Holder［12］認(rèn)為兩個(gè)波的起源不同。藥理學(xué)分析也證明，N95波可被河豚毒素完全阻斷，N95波依賴于RGC產(chǎn)生的動(dòng)作電位。盡管P50波的確切起源還不清楚，并不能被河豚毒素阻斷，但在青光眼患者和猴青光眼模型中P50波振幅均有所下降，因此推測(cè)它可能起源于RGC的胞體和（或）RGC的遠(yuǎn)端［13］。以往評(píng)價(jià)慢性高眼壓引起的RGC數(shù)目減少常常采用閃光ERG［14］，然而閃光ERG只代表視網(wǎng)膜外層電反應(yīng)，PERG才真正代表視網(wǎng)膜內(nèi)層電反應(yīng)［15， 16］。迄今，盡管對(duì)PERG的確切起源尚未完全清楚，但起源于視網(wǎng)膜內(nèi)層是一致公認(rèn)的，主要是RGC［17］。Berardi等［18］證實(shí)橫斷大鼠視神經(jīng)后可引起RGC逆行性變性，導(dǎo)致PERG反應(yīng)消失，而閃光ERG不受影響。目前PERG已被應(yīng)用于臨床評(píng)價(jià)高眼壓癥和青光眼患者的視功能，并認(rèn)為青光眼對(duì)PERG的N95的影響比P50大［19， 20］。BenShlomo等［9］首次應(yīng)用PERG評(píng)價(jià)大鼠高眼壓后RGC功能，并研究N95振幅和RGC數(shù)目的相關(guān)性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩者呈正相關(guān)關(guān)系。我們的研究也證明豚鼠視神經(jīng)橫斷后，隨著RGC數(shù)目的減少N95振幅逐漸降低，且兩者呈正相關(guān)關(guān)系（r=0.858 68，P=0.001 5），表明PERG的N95振幅可評(píng)價(jià)RGC數(shù)目喪失的程度。
總之，腹腔注射EGb 761可抑制視神經(jīng)橫斷后RGC凋亡，從而保護(hù)RGC的結(jié)構(gòu)和功能。PERG是評(píng)價(jià)視神經(jīng)橫斷后RGC喪失程度的有效指標(biāo)之一。
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